Изучение препарата Панавир на инфекцию, вызванную вирусами гриппа типа А

ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ. Прокудина Е.Н., Семенова Н.П., Галегов Г.А. Литвин А.А.,Стовбун С.В., Сергиенко В.И.

Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae, роду Influenza virus, включающему типы А, В и С. Вирусы гриппа А и В являются возбудителями заболеваний человека и некоторых млекопитающих и птиц, типа С – животных. Возбудители гриппа А и В ответственны за ежегодные эпидемии. В настоящее время известно 15 подтипов гемагглютинина (НА) и 10 подтипов нейраминидазы (NA) вирусов гриппа типа А, циркулирующих среди позвоночных. По данным вирусологических, иммунологических и сероархеологических исследований, эпидемии и пандемии, начиная с 1889 года, были вызваны вирусами, имеющими гемагглютинин Н1, Н2 или НЗ и нейраминидазу N1 или N2. Эти возбудители объединены в три подтипа вируса гриппа А человека: А(Н1N1), A(H2N2) и A(H3N2), в появлении которых наблюдается определенная цикличность в эпидемиологическом аспекте.

Поиск средств лечения гриппа остается одной из актуальнейших проблем современной медицины, равно как и исследование механизмов развития гриппозной инфекции и механизмов эффективности веществ, обладающих антигриппозной активностью. Известно, что от количества и биологической активности лимфоцитов зависит иммунитет, как “антительный” (В-лимфоциты), так и “клеточный” (Т-лимфоциты). Применение веществ, обладающих митогенной активностью, может в значительной мере способствовать стимуляции иммунитета и противодействию организма чужеродным инфекционным агентам. Под митогенной активностью веществ подразумевается их способность “генерировать” митозы лимфоцитов и, следовательно, стимулировать их размножение (“пролиферацию”).

Проявление некоторыми веществами митогенной активности in vitro позволяет их рассматривать как представителей класса иммуномодуляторов, способных стимулировать иммунитет in vivo. В современной литературе имеются сведения о проявлении in vitro иммуномодуляторных свойств веществами растительного происхождения, к которым относится и Панавир. В настоящее время Панавир в качестве противовирусного лекарственного средства применяется для лечения герпесвирусных инфекций, эффективен при терапии инфекций, вызванных вирусом папилломы человека . В условиях in vitro Панавир обладает способностью тормозить репликацию вируса гепатита С, повышать жизнеспособность инфицированных этим вирусом культур клеток SW-13.

Известно, что часто вещества, обладающие митогенным действием при некоторых вирусных инфекциях, в частности, при ВИЧ-инфекции, оказывают выраженный терапевтический эффект. Одним из лабораторных критериев иммуномодуляторного действия веществ является исследование их митогенного действия in vitro в реакции бласттрансформации лимфоцитов, называемой также реакцией стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов.

Целью настоящей работы является оценка антигриппозной активности Панавира. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: 1) изучение возможного влияния препарата Панавир на репродукцию вируса гриппа в различных репродуктивных клеточных системах in vitro; 2) исследование митогенных свойств Панавира как возможного механизма его противогриппозного действия; 3) изучение противовирусной активности Панавира в условиях экспериментальной гриппозной инфекции на мышах.

Материалы и методы исследования.

Изучение влияния Панавира на репродукцию вируса гриппа в репродуктивных клеточных системах in vitro.

Вирус. Использовали один из широко используемых в экспериментальных модельных исследованиях штамм вируса гриппа: A/WSN/33(H1N1).

Клетки. Репродукцию вируса гриппа исследовали в перевиваемой культуре клеток почек эмбрионов собаки – MDCK.

Препарат. Разведения препарата Панавир (субстанция производства

ООО «Флора и Фауна», РФ) готовили в питательной среде, адекватной для используемых клеточных систем.

С целью исследования возможного вмешательства Панавира в основные биохимические процессы клетки было исследовано его влияние на синтезы ДНК, РНК и белка. Клетки MDCK инкубировали с Панавиром в концентрации 10 мкг/мл в течение 24 часов, после чего их заливали средой, содержащей радиоактивные предшественники синтеза ДНК (ЗН тимидин), РНК (ЗН уридин) или белка (14С аминокислоты), и инкубировали 2 часа. Радиоактивность препаратов регистрировали в кислото-нерастворимом материале клеток в спектрометре.

При изучении влияния Панавира на репродукцию вируса гриппа в культуре клеток MDCK клетки заражали вирусом гриппа в дозах от 0,01 до 10 ИД50 на клетку. Панавир вводили одновременно с вирусом или перед заражением вирусом. Репродукция вируса гриппа оценивалась на основании определения в вируссодержащем материале титров.

При изучении влияния препарата на синтез вирусных белков клетки MDCK заражали вирусом гриппа при множественности заражения – 10 ИД 50 на клетку. Панавир в концентрациях 10, 100, 500 и 1000 мкг/мл применяли в двух вариантах. В первом варианте препарат вводили сразу же после заражения. Через 6 часов после заражения в клетки вводили 14С аминокислоты на 1 час. Во втором варианте Панавир вводили в культуральную среду клеток за ночь до заражения. Затем клетки заражали и повторно заливали указанными концентрациями Панавира. 14С аминокислоты вводили аналогично первому варианту (через 6 часов после заражения). Вирусные белки анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПАГЕ).

Исследование митогенной активности Панавира.

Митогенную активность Панавира (0-40 мкг/мл) исследовали классическим методом бласттрансформации лимфоцитов. Готовили культуру селезеночных мышиных лимфоцитов (1млн клеток в 1 мл), которую расфасовывали в лунки многолуночных планшет. К лимфоцитам добавляли различные концентрации Панавира. Препарат был предоставлен в виде субстанции (производства ООО «Флора и Фауна», РФ). Лимфоциты выдерживали с Панавиром при +37°С в течение 48 часов. Для оценки интенсивности синтеза ДНК в лимфоцитах в каждую лунку вводили предшественник синтеза ДНК ЗН-тимидин, и образцы инкубировали при +37°С в течение 3 часов. Анализировали радиоактивность кислото-нерастворимого материала, которую просчитывали в спектрометре фирмы “Бекман”. Результаты учитывали по абсолютным показателям радиоактивности или по индексу стимуляции (ИС), где ИС= имп.мин стимул./имп.мин контроль.

Исследование антигриппозных свойств Панавира в условиях ин виво.

Эксперименты выполнены на белых аутбредных мышах весом 9-11 г (питомник “Светлые горы”), содержащихся в стандартных условиях при естественном световом режиме. Животных заражали интраназально вирусом гриппа А штамм Aichi Н3N2 2/2/68 (резистентная и нерезистентная к ремантадину популяции штамма, инфицирующая доза 5ЛД50). Резистентный к ремантадину штамм вируса гриппа типа А Aichi Н3N2 2/68 получали в условиях стандартной процедуры пассирования штамма вируса в клетках MDCK в присутствии возрастающих концентраций ремантадина от 2 дл 10 мкг/мл. После 6-го пассажа этот штамм приобретал выраженную резистентность к ремантадину и использовался для заражения мышей.

Панавир использовали в виде стерильного изотонического раствора, содержащего 200 мкг активной субстанции в 0,4 мл. Панавир в дозе 0,4 мл вводили внутривенно дважды: через 24 и 96 часов после заражения животных. В качестве препарата сравнения использовали известный противогриппозный препарат ремантадин, который вводили животным дважды в дозе 40 мг/кг внутрь.

Результаты исследования и обсуждение.

Влияние Панавира на репродукцию вируса гриппа в репродуктивных клеточных системах in vitro.

В использованной концентрации (10 мкг/мл) Панавир не обладает ни стимулирующим, ни ингибирующим действием на синтез ДНК, РНК и белка клеток, что свидетельствует об отсутствии токсических свойств у препарата в отношении клеток и стимулирующего воздействия на синтез макромолекул (табл.1). При заражении большими дозами вируса гриппа клеток MDCK выявляется тенденция к двухкратно- и четырехкратному ингибирующему действию препарата на вирусную репродукцию, что не обнаруживается при снижении заражающих доз (табл.2). Данный эффект может объясняться некоторой стимуляцией вирусспецифических синтезов и, как результат, усиление аутоинтерференции вирусной репродукции, характерной для высокой множественности инфекции.

На рис. 1 видно, что при первом способе введения Панавира имеют место два типа влияния препарата в зависимости от его доз. При использовании препарата в дозах 10 и 100 мкг/мл наблюдали некоторую стимуляцию синтеза вирусных белков (NP, НА), в дозах 500 и 1000 мкг – некоторое подавление.

Как свидетельствует рис. 2, при предварительном введении Панавира имеет место некоторая стимуляция синтеза вирусных белков при дозах 10 и 100 мкг/мл и заметное ингибирование синтеза вирусных белков при дозах 300 и 1000 мкг/мл.

Таким образом, Панавир оказывает некоторое стимулирующее действие на синтез вирусных белков при предварительном введении препарата в концентрациях 10 и 100 мкг/мл и ингибирующее действие на синтез вирусных белков при дозах 500 и 1000 мкг/мл, не проявляя токсических свойств в отношении клеток в достаточно высоких концентрациях, что допускает возможность изучения действия Панавира при гриппозной инфекции in vivo.

Митогенная активность Панавира.

На рисунке 3 показана зависимость митогенной активности Панавира от концентрации. Результаты представлены в абсолютных показателях радиоактивности (имп./мин). Контроль (образцы без Панавира – 500 имп./мин). Установлено, что в условиях in vitro Панавир обладает выраженным митогенным эффектом. В диапазоне используемых доз (до 40 мкг/мл) препарат не обнаружил токсических свойств в отношении лимфоцитов.

Выраженная митогенная активность Панавира в нетоксических дозах позволяет рассматривать данный препарат как перспективный иммуномодулятор при вирусных инфекциях, сопровождающихся снижением иммунитета.

Антигриппозные свойства Панавира в условиях экспериментальной инфекции на мышах.

При заражении животных контрольной группы нерезистентным к ремантадину вирусом гриппа А регистрировали гибель 55% мышей, средняя продолжительность жизни животных составила 11±0,3 дня. Двукратное применение Панавира вызывало увеличение выживших животных на 25% и их средней продолжительности жизни на 2 дня. Известный противогриппозный препарат ремантадин способствовал выживанию всех животных, инфицированных вирусом гриппа А (табл. 3).

При заражении мышей резистентным к ремантадину вирусом гриппа типа А наблюдали гибель 45% животных. Под влиянием двукратного применения Панавира гибель животных снизилась на 25%. Ремантадин в данных условиях не защищал зараженных животных от гибели (табл.3). Таким образом, установлено, что Панавир обладает противогриппозной активностью как в отношении устойчивой, так и неустойчивой в отношении ремантадина популяций вируса гриппа типа А в условиях экспериментальной инфекции на мышах.

Данные настоящего исследования об отсутствии токсических свойств Панавира в отношении клеток МСDК и влияния на синтез белков клеток культуры согласуются с результатами ранее проведенных исследований, в которых было показано, что препарат обладает относительно низким цитотоксическим и антипролиферативным действием в отношении целого ряда клеточных культур (перевиваемые клетки линии Vero, диплоидные клетки фибробластов эмбрионов человека, клетки SW-13).

Наличие у Панавира митогенных свойств, способности подавлять синтез вирусных белков вируса гриппа А в клеточных системах in vitro, защитного действия в условиях экспериментальной инфекции на животных существенно расширяет представление о его спектре фармакологической активности как противовирусного лекарственного средства. Ранее исследования in vitro выявили поливалентную противовирусную эффективность препарата при лечении ряда экспериментальных вирусных инфекций, в частности индуцируемых цитомегаловирусом, вирусами простого герпеса 1 и 2 типов, вирусом гепатита С, что может свидетельствовать о способности Панавира стимулировать неспецифическую резистентность биологических систем в отношении широкого ряда вирусов. Данное предположение в настоящее время находит отражение в ходе клинического применения Панавира. Так, в настоящее время препарат показан в терапии герпесвирусных инфекций, вызванных вирусами простого герпеса 1 и 2 типов, и хронического клещевого энцефалита. При терапии вышеупомянутых герпесвирусных инфекций Панавиром была выявлена положительная динамика в течении сочетанных вирусных заболеваний, в частности цитомегаловирусной и папилломавирусной инфекций, Эпштейн-Барр инфекции.

Как отмечалось выше, одним из лабораторных критериев иммуномодулирующих свойств вещества являются его митогенные эффекты в отношении иммунокомпетентных клеток. Это согласуется с тем, что наличие у Панавира митогенного действия в тесте блосттрансформации лимфоцитов сочетается с выраженными иммуномодулирующими свойствами, выявленными при применении препарата в клинике. Так, в результате проведенной терапии Панавиром у пациентов с рецидивирующим генитальным герпесом регистрировали статистически достоверное повышение относительного и абсолютного показателя CD16+-клеток, индекса CD4+/CD8+, тенденцию к увеличению содержания уровня лейкоцитов, иммуноглобулинов класса М, а также тенденцию к снижению относительного содержания лимфоцитов. Использование комплексного лечения с системным введением Панавира у пациентов с папилломавирусной инфекцией сопровождалось восстановлением интерфероногенеза-a- и -g, показателей клеточного иммунитета и естественной резистентности. Уровень иммуноглобулинов А, М и ЦИК увеличивался и достигал нормальных показателей. Изменение уровня иммуноглобулинов при этом сопровождалось формированием устойчивости больных к вирусным инфекциям.

Таким образом, сочетание противогриппозной активности, выявленной в модельных условиях in vitro и in vivo, и выраженные иммуномодулирующие свойства определяют перспективы применения Панавира в качестве лекарственного средства для лечения гриппа, вызванного вирусами типа А. Особую значимость противогриппозная активность препарата может иметь при лечении инфекций, вызванных ремантадин-резистентными штаммами вируса.

Выводы.

1. Панавир при предварительном введении оказывает ингибирующее действие на синтез вирусных белков при дозах 500 и 1000 мкг/мл, не проявляя токсических свойств в отношении клеток в достаточно высоких концентрациях, что допускает возможность изучения действия Панавира при гриппозной инфекции in vivo.

2. Панавир в нетоксических дозах обладает митогенным эффектом в условиях метода бласттрансформации лимфоцитов.

3. Панавир обладает противогриппозной активностью как в отношении устойчивой, так и неустойчивой в отношении ремантадина популяций вируса гриппа типа А в условиях экспериментальной инфекции на мышах.

Рисунок 3. Влияние Панавира на митогенную активность в условиях теста.

По горизонтали представлена концентрация Панавира (мкг/мл), по вертикали – 3Н радиоактивность (имп./мин).

Таблица1. Влияние Панавира на внутриклеточные синтезы не зараженных вирусом гриппа клеток MDCK.

Вещество, доза	ДНК	РНК	Белок
Панавир 10 мкг/мл	9205	125000	125000
0 мкг/мл	8720	123700	100000

Таблица 2. Влияние Панавира на репродукцию вируса гриппа в клетках MDCK.

Концентрация Панавира, мкг/мл	Доза за­ражения 10 ИД 50/КЛ	Доза зара­жжения 1 ИД5О/кл	Доза зара­жжения 0,1 ИД50/кл	Доза зара­жения 0,01 ИД50/кл
100	32 ГАЕ	64 ГАЕ	64 ГАЕ	16 ГАЕ
10	64 ГАЕ	64 ГАЕ	64 ГАЕ	16 ГАЕ
0	128 ГАЕ	128 ГАЕ	64 ГАЕ	16 ГАЕ

Таблица 3. Влияние Панавира (0,016 мг, в/в) на экспериментальную гриппозную инфекцию Aichi Н3N2/2/68 у белых мышей .

Препарат	Доза, мг мг/кг	Выжившие/ погибшие мыши	Выживаемость, %	Защита, %	Средняя продолжительн. жизни (дни)
Неризистентная к ремантадину популяция штамма вируса гриппа А
Панавир	0,4	14/6	70	25	13±0,6
Ремантадин	80	20/0	100	55	15±0,2
Физ.р-р	Экв. объем	9/11	45	-	11±0,3
Резистентная к ремантадину популяция штамма вируса гриппа А
Панавир	400	14/6	70	25	15 ±0,3
Ремантадин	160	8/12	40	0	13 ±0,1
Физ.р-р	Экв. объем	9/11	45	-	13 ±0,4

---

Задать вопрос

Отзывы о Панавир, вопросы, комментарии врача

Есть вопрос? Задайте!