Горячая линия: 8 800 555-222-9 (Звонок по России бесплатный)

Влияние Панавира на синтез вирусных белков простого герпеса

ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН *ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ. Кущ А.А., Климова Р.Р., Стовбун С.В.*, Литвин А.А.*, Сергиенко В.И.*

Вирусы простого герпеса (ВПГ) типа 1 и 2 относятся к подсемейству альфа семейства герпесвирусов, характеризуются одинаковыми относительно короткими репродуктивными циклами, эффективным разрушением зараженных клеток и способностью существовать в латентной форме, преимущественно, хотя и неисключительно, в ганглиях. ВПГ1 и ВПГ 2 имеют одинаковую молекулярную массу, состав оснований ДНК герпесвирусов этих подтипов (G+C) отличается не более, чем на 1 %. Неоднородность популяций молекул ДНК по составу оснований у ВПГ1 и ВПГ2 весьма незначительна, эти вирусы содержат гомологичные участки, выявляющиеся даже при очень строгих условиях гибридизации. И как следовало ожидать, наличие гомологичных областей генома вирусов предопределяет их сходство биологических и патогенных свойств.

В клетках, подвергшихся продуктивному заражению ВПГ, регуляция экспрессии вирусных генов имеет характерные особенности. А именно, белки ВПГ образуют по крайней мере пять координированно регулируемых групп в отношении необходимых условий и кинетики их синтеза. Абсолютная скорость синтеза и количество каждого из белков могут варьироваться, при этом белки синтезируются строго в определенной последовательности и их синтез носит каскадный характер [Honess, Roizman,1973; Pereira et al., 1977].

Первыми экспрессируются альфа-гены, кодирующие пять альфа-белков (сверхранние) , синтез которых достигает максимальной скорости через 2-4 часа после заражения, а затем скорость синтеза уменьшается [Honess, Roizman,1975]. Функционирование альфа-белков, в частности белка альфа-4, является необходимым условием для синтеза последующих полипептидов группы бета (ранние), достигающей максимальной скорости синтеза через 5-7 часов после инфицирования. Полипептиды подгруппы бетта 1 , в которую в частности входят белки бета 1 -6 (компонент вирусной рибонуклеотидредуктазы) [Huszar, Bacchetti, 1983] и бетта 1 -8 (главный ДНК-связывающий белок), появляются уже на ранних стадиях заражения, но отличаются от альфа-белков тем, что для их синтеза необходимо присутствие функционирующего белка альфа-4.

К полипептидам подгруппы бета 2 относятся вирусная тимидинкиназа и ДНК-полимераза. Бета-полипептиды участвуют в отключении синтеза альфа-белков и индукции гамма-генов [Honess, Roizman, 1974; 1975]. Белки ВПГ группы гамма составляют подгруппу поздних полипептидов. Большинство идентифицированных к настоящему времени гамма-белков являются компонентами вириона, и на их долю приходится около 50% известных продуктов генов ВПГ. Некоторые структурные белки, синтезируемые на поздних стадиях инфекции, функционируют на ранних стадиях.

Известно, что некоторые из них способствуют освобождению вирусной ДНК из капсидов и прохождению ее через ядерные поры [Batterson et al., 1983], участвуют в процессе отключения синтеза клеточных белков сразу после заражения и индуцируют экспрессию альфа-генов [Batterson, Roizman, 1983; Read, Frenkel, 1983; Post et al., 1981].

Влияние фармакологических агентов на синтез вирусных белков может являться важным субстратом их противовирусного эффекта. Отечественный противовирусный препарат Панавир является новым лекарственным средством, созданным на основе физико-химических процессов выделения биологически активных веществ из быстро делящихся клеток растений. Действующая субстанция препарата представляет растительный биологически активный полисахарид, относящийся к классу гексозных гликозидов.

Экспериментальные исследования показали противовирусную эффективностьПанавира в условиях in vitro в отношении вируса гепатита С (штамм 1b), вирусов простого герпеса 1 (штамм F) и 2 (штамм G) типа, цитомегаловируса (референс-штамм АД 169) [ Климова Р. И соавт., 2004]. В клинической практике препарат показан при вирусных инфекциях у пациентов с нормальной или ослабленной иммунной системой при инфекциях кожи и слизистых, вызванных вирусами герпеса и вирусоносительстве клещевого энцефалита [ Машковский , 2005 ] .

Целью настоящей работы является исследование влиянияПанавир на синтез сверхранних, ранних и поздних белков ВПГ-1 и ВПГ-2 в условиях культуры клеток перевиваемой линии Vero.

Материалы и методы.

Вирусы.

В работе были использованы следующие штаммы ВПГ: ВПГ-1 – штамм F, ВПГ-2 – штамм G, любезно предоставленные проф. Л. Перейра (Медицинский Центр Университета г. Сан-Франциско, Калифорния, США).

Клетки.

Для анализа анти-ВПГ активности препарата использовали клетки перевиваемой линии Vero, являющиеся высоко чувствительными к ВПГ. Клетки Vero культивировали в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глютамина и гентамицина.

Препарат Панвир.

Исследована субстанция препарата Панавир (субстанция ООО “Флора и Фауна+”, РФ). Разведения препарата, содержащие различные концентрации Панавира, готовили на питательной среде для выращивания клеток без добавления сыворотки.

Профилактическая схема.

Для определения профилактического противовирусного эффекта препаратаПанавир культуру клеток Vero обрабатывали за 24 часа до инфекции. Использовали следующие концентрации препарата: от 1000 мкг/мл до 2,5 мкг/мл. Клетки инфицировали ВПГ-1 и ВПГ-2 с ИМ от 0,01 БОЕ/мл до 0,00001 БОЕ/мл.

Определение действия Панавира на инфекционную активность вируса.

Для анализа действия препарата Панавир на инфекционную активность ВПГ-1 и ВПГ-2 препарат вносили в культуру клеток Vero, зараженных ВПГ-1 и ВПГ-2 с ИМ 0,001 БОЕ/кл и 0,0001 БОЕ/кл и культивировали до развития полного ЦПД в контроле (без препарата), которое наблюдалось через 4 дня. Вируссодержащую культуральную жидкость, отобранную на 4 день, вносили в свежие неинфицированные клетки без добавления препарата Панавир. Об инфекционной активности вируса в опытных и контрольных образцах судили по развитию ЦПД.

Влияние Панавира на синтез белков ВПГ в вирулицидной схеме.

Для оценки влияния препарата Панавир на синтез белков ВПГ, клетки Vero, выращенные на покровных стеклах, заражали ВПГ-1 и ВПГ-2 с ИМ 0,001 и 0,0001 БОЕ/кл. Препарат Панавир в концентрации 10 мкг/мл вносили в момент заражения. Клетки, инфицированные ВПГ-1, фиксировали через 24 и 48 часов. Клетки, инфицированные ВПГ-2, фиксировали через 48 и 72 часа. Фиксированные препараты клеток окрашивали МКА к сверхранним, ранним и поздним белкам ВПГ методом нИФ.

Результаты.

Ранее было показано, что препарат Панавир обладает относительно низким цитотоксическим и антипролиферативным действием в отношении перевиваемых клеток линии Vero: 50%-ная цитотоксическая доза (ЦД 50 ) препарата составляет 1000 мкг/мл. Также было показано, что Панавир в концентрации 10 мкг/мл обладает способностью тормозить развитие вируспецифического ЦПД, вызванного ВПГ-1 и ВПГ-2 при заражении с ИМ 0,001 БОЕ/мл.

При исследовании профилактического действия препарата установлено, что при концентрации 5,0 мкг/мл Панавир подавляет ЦПД как ВПГ-1, так и ВПГ-2 с ИМ 0,001 БОЕ/кл на 90%, а при концентрации 10 мкг/мл – на 50% (табл.1).

При заражении культуры клеток с ИМ 0,0001 БОЕ/мл ВПГ 1 и 2 типа Панавир в концентрации 2,5 мкг/мл вызывает 50%-ное подавление инфекционной активности вируса. Изучение продукции инфекционно активного вируса показало, что происходит торможение вирусспецифического ЦПД на 2-3 суток.

Результаты анализа экспрессии вирусных белков в клетках Vero, обработанных препаратом Панавир в момент заражения, представлены в табл.2. Установлено, что препарат Панавир не подавляет экспрессию всех трех исследованных белков ВПГ-1 при заражении с ИМ 0,001 БОЕ/мл через 48 часов после инфицирования. Через 24 часа после заражения ВПГ-1 с ИМ 0,001 и 0,0001 БОЕ/мл наблюдали экспрессию сверхранних и ранних белков. Что касается поздних белков, то было показано, что препарат Панавир подавляет накопление данных белков через 24 часа после инфицирования.

Изучение действия препарата Панавир на экспрессию белков ВПГ-2 показало, что экспрессия сверхранних и ранних белков была одинаковой при заражении с ИМ 0,0001 БОЕ/мл через 48 и 72 часа после инфицирования. Экспрессия поздних белков была низкой (менее 10% окрашенных клеток) при ИМ 0,001 БОЕ/мл через 72 часа после инфицирования и не наблюдалась при остальных вариантах исследования. При заражении клеток Vero ВПГ-2 с ИМ 0,0001 БОЕ/мл было показано, что препарат Панавир полностью подавляет экспрессию всех трех вирусных белков от момента заражения и вплоть до 48 часов после инфицирования.

Таблица 1. Профилактическое действие препарата Панавир на клетки Vero, зараженные ВПГ 1 типа и ВПГ 2 типа

Показатель

ВПГ-1

ВПГ-2

Множественность инфицирования, БОЕ/мл.

0,1

0,01

0,001

0,0001

0,1

0,01

0,001

0,0001

ИД 50 , мкг/мл

-

-

10

5

-

-

10

5

ИД 95 , мкг/мл

-

-

5

2,5

-

-

5

2,5

ХТИ

-

-

100

200

-

-

100

200

Примечание. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) вычислялся как отношение ЦД 50 к ИД 50 .

ЦД 50 =1000 мкг/мл.

Таблица 2. Экспрессия белков ВПГ-1 и ВПГ-2 в клетках Vero в присутствии препарата Панавир

Белки ВПГ

ВПГ-1

ВПГ-2

множественность инфицирования, БОЕ/мл

0,001

0,0001

0,001

0,0001

0,001

0,0001

0,001

0,0001

сроки инфицирования, часы

24

48

48

72

сверхранние (α)

++

+

+++

+++

+

-

++

+

ранние (β)

++

+

+++

+++

+

-

+

+

поздние (γ)

-

-

+++

+

-

-

+

-

Примечание:

"+" – менее 10% окрашенных клеток;

"++" – менее 50% окрашенных клеток;

"+++" – более 50% окрашенных клеток;

"-" – нет окрашенных клеток.

Выводы.

1. Препарат Панавир полностью подавляет экспрессию поздних белков ВПГ 1 типа через 24 часа после заражения с ИМ 0,001-0,0001 БОЕ/мл.

2. Препарат Панавир полностью подавляет экспрессию поздних белков ВПГ 2 типа через 48 часов после заражения с ИМ 0,001 БОЕ/мл и через 72 часа после заражения с ИМ 0,0001 БОЕ/мл.

3. Препарат Панавир полностью подавляет экспрессию всех изученных (сверхранних, ранних и поздних) белков ВПГ 2 типа в течение 48 часов после заражения с ИМ 0,0001 БОЕ/мл.

4. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) для препарата Панавир , рассчитанный как отношение ЦД 50 /ИД 50 , в условиях наших опытов равен 100-200 для ВПГ 1 и 2 типа в профилактической схеме исследований.


Отзывы о Панавир, вопросы, комментарии врача

Вопросы и ответы

ЗАДАТЬ ВОПРОС СПЕЦИАЛИСТУ


Вы можете задать вопрос в специальном разделе сайта панавир и получить развернутый ответ специалиста

Награды
ЛАУРЕАТ ПРЕМИИ ПРАВИТЕЛЬСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 2013
Распоряжение №230-р от 20 февраля 2014г. Правительства Российской Федерации
Новости

Для врачей


Для пациентов


ПОДПИСКА НА НОВОСТИ МЕДИЦИНЫ

Чтобы подписаться на новости медицины введите Ваш адрес электронной почты в поле ниже
Подробнее о подписке