Горячая линия: 8 800 555-222-9 (Звонок по России бесплатный)

Активация неспецифического иммунитета наночастицами полисахаридов растений, как противовирусное средство (перевод).

Аннотация

Разработка высокотехнологичных таргетных лекарств и вакцин против современных пандемических инфекций, таких как COVID-19, может занять слишком много времени, что позволит эпидемии разрастаться и причинить вред обществу. Однако в этот период необходимо применять контрмеры против инфекции, пока не станут доступны целевые лекарства. В этом отношении неспецифические противовирусные средства широкого спектра действия можно рассматривать как компромисс, позволяющий преодолеть период испытаний. Один из способов повысить способность противостоять инфекции - активировать неспецифический иммунитет с помощью подходящего возбуждающего агента, такого как полисахариды растений, в частности, наш препарат Панавир, выделенный из побегов картофеля.

Ранее мы показали заметную противовирусную и антибактериальную активность Панавира. Здесь мы демонстрируем провоспалительную активность панавира, который в четыре-восемь раз усиливал секрецию АТФ и MIF клетками HL-60. Этот эффект был опосредован активным фагоцитозом частиц панавира клетками. Мы предположили, что физиологическая основа провоспалительной активности Панавира опосредуется индолсодержащими соединениями (ауксинами), присутствующими в Панавире и действующими как растительный аналог серотонина.

Ключевые слова: противовирусная активность, иммуномодулятор, COVID-19.

Введение

Пандемия COVID-19, вызванная вирусом SARS-CoV-2, ясно показала, что у человечества пока нет надежных и эффективных средств быстрого реагирования на такие глобальные вызовы.

Стандартный протокол включает:

  • соблюдение карантина и использование средств индивидуальной защиты;
  • разработка диагностических инструментов и специфического лечения;
  • разработка вакцины против нового возбудителя.

Эффективность и безопасность самых быстрых мер (первый пункт в списке выше) вызывает ожесточенные споры, и аргументы оппонентов весьма убедительны. Остальные вопросы, перечисленные выше, требуют времени, тогда как пандемия набирает обороты и может нанести непоправимый ущерб обществу. РНК-вирусы, включая SARSCoV-2, сильно различаются, поэтому затраты на разработку новых средств специфической профилактики и лечения могут стать слишком значительными [1]. Более того, разработка эффективной вакцины против многих РНК-вирусов (включая коронавирусы) может быть дополнительно осложнена эффектом антигенного импринтинга или феноменом «исходного антигенного греха» (OAS, [2, 3, 4]) и «антителом». -зависимое усиление» (ADE, [5, 6, 7, 8]).

Наиболее ярким примером, демонстрирующим сложность этой проблемы, является время, которое человечество уже потратило на создание эффективной вакцины против ВИЧ-инфекции и еще не могло ее создать, хотя с момента открытия этого вируса прошло 36 лет. Вакцина против Эболы была зарегистрирована и признана ВОЗ только в 2019 году, через 43 года после обнаружения вируса. Кроме того, специалисты добились небольшого прогресса в разработке вакцины против респираторно-синцитиального вируса, несмотря на огромные инвестиции [1].

Одним из подходов к решению обозначенной глобальной проблемы является создание малотоксичных агентов для неспецифической активации врожденного иммунитета. Последнее ускорит развитие первичного ответа и снизит вероятность тяжелого течения болезни. Мы предполагаем возможность целенаправленного фармакологического воздействия на врожденный иммунитет, которое может перевести его в некое гипотетическое «состояние повышенной ответственности» (СИНРЕС). Клетки врожденного иммунитета, в частности естественные клетки-киллеры, могут приобретать иммунную память аналогично клеткам адаптивного иммунитета и повышать свою активность в ответ на антигенную стимуляцию [9, 10, 11].

Такие обученные или спровоцированные иммунные клетки могли бы служить основой состояния SINRES [12, 13], которое, однако, никогда ранее не вводилось как отдельное понятие. Ранее нами было показано, что частицы высокомолекулярного полисахарида, экстрагированного из побегов картофеля (Панавир), обладают широким спектром противовирусной активности [14, 15, 16]. Противовирусная активность была продемонстрирована против широкого спектра микробов, включая как ДНК, так и РНК-содержащие вирусы, такие как, например, коронавирусы животных - близких родственников SARS-CoV-2, а также против вируса гриппа, герпеса, цитомегаловируса, вируса клещевого энцефалита, вируса папилломы человека и вируса гепатита С.

Столь широта фармакологической активности препарата заставляет искать механизм его действия среди неспецифических иммунологических реакций. До сих пор мы считали, что основной механизм противовирусной активности Панавира обусловлен его способностью стимулировать секрецию интерферонов, которые являются одним из координирующих факторов врожденного иммунитета [17]. Несомненно, это свойство является одним из ключевых, поскольку тяжесть патологий, вызванных вирусными инфекциями 2, напрямую коррелирует с дефектами в системе интерферона, что недавно было показано у пациентов с COVID-19 [18, 19].

Кроме того, Панавир проявляет нейропротекторную и антибактериальную активность, а также подавляет аутоиммунные расстройства [16], что трудно объяснить только индукцией интерферонов. В то же время такое разнообразие фармакологических эффектов должно быть связано с каким-то фундаментальным механизмом врожденной защиты, где инфекция, по-видимому, является одним из, но не единственным, потенциально опасным фактором. Таким фундаментальным механизмом может быть фагоцитоз, а также каскады иммунологических реакций, запускаемых внеклеточным экзоцитозом АТФ и MIF [20, 21]. Причем эти процессы должны происходить в первую очередь в эпителиальных клетках дыхательных путей - воротах респираторных инфекций. Пул медиаторов неспецифического иммунного ответа должен формироваться в этих клетках специально для привлечения клеток неспецифического иммунитета, которые в дальнейшем будут участвовать в подавлении вирусной инфекции [22].

Методы

Панавир

Панавир представляет собой высокомолекулярную (~ 3 · 109 Да) фракцию полисахаридов, экстрагированных из побегов Solanum tuberosum (картофель). Вещество выделяли из измельченной меристематической ткани промыванием и последующей фильтрацией полученной жидкости. Частицы панавира имеют форму, близкую к сферической, с диаметром около 300 нм. Электрокинетический (дзета) потенциал частиц отрицательный и равен -25 мВ. Химический состав Панавира весьма разнообразен: глюкоза (10–67%), галактоза (2–27%), арабиноза (3–15%), рамноза (2–10%), манноза (0,1–5%), и ксилоза (0,1–3%). Также он содержит уроновые кислоты (2–5%), следы липидов, пептидов и белков, в первую очередь RuBisCo (всего менее 1%). ИК-спектр Панавира очень близок к спектру крахмала, поскольку определяется в основном гексозами.

Наиболее интенсивными спектральными полосами были 1150 см-1 (асимметричное растяжение C-O-C), 1079 см-1 (изгибные C-O и связанные с CH2 моды), 1024 см-1 (валентное колебание C-OH) и 928 и 854 см-1 (симметричное растяжение C-O-C и деформация C-H). В спектре также присутствуют уширенные полосы в области 1450–1200 см – 1, которые можно отнести к деформационным связям C – H, асимметричному колебанию в группе CH2 и растяжению связи C = O. Отсутствие йодной окраски указывает на сшивание полимеров гексозы, что препятствует образованию клатратов канального типа, ответственных за характерную синюю окраску [23, 15]. В рентгеновских спектрах высушенного панавира обнаружено только аморфное гало без каких-либо признаков упорядочения (данные не показаны).

Культивирование клеток

Линия клеток миелоидного лейкоза человека HL-60 была приобретена в Венгерском банке клеток, Институт Пазера Венгрии, Сегед, код NCBI C427. Клетки поддерживали в суспензионной культуре при +37 ° C и 5% CO2 / воздух в среде RPMI 1640 (Gibco, UK) с добавлением 10% FCS и антибиотиков: 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Клетки пересевали три раза в неделю, ATRA (Sigma, США). Эта процедура была первоначально принята Olins et al. [24], а затем модифицированы Роем и др. [25]. Первичные эпителиальные клетки носа человека (NHEpC), выделенные из здоровой слизистой оболочки носа человека, мужчины-доноры в возрасте 18–25 лет (PromoCell, GmbH, Германия, кат. № C-14062) также культивировали в стандартных условиях [26].


Рисунок 1: Инфракрасные спектры панавира (красный) и крахмала (синий). Для наглядности спектры были разделены на две области: 3800–2600 см – 1 (A) и 1600–700 см – 1 (B). Произвольные единицы на графиках A и B одинаковы.

Эксперименты проводились как с исходными незрелыми клетками HL-60, так и с зрелыми нейтрофилами, полученными обработкой культуры HL-60 1,25% ДМСО в течение 96 часов [27, 28]). Раствор панавира в бидистиллированной воде добавляли к суспензии культуры клеток (20–30 млн клеток на мл) и инкубировали 2, 6, 12 и 24 часа. Совместное действие Парнавира и АТФ также исследовалось. Реагенты добавляли в культуральную среду одновременно, и конечная концентрация АТФ составляла 0,5 мкг / мл. После инкубации клетки собирали центрифугированием (20 000 об / мин, 20 мин, 4 ∘C) и промывали 50 мМ PBS (pH 8,2). Затем клетки лизировали 2% раствором Triton X-100 (10 мин, 4 ∘C) и подвергали ультрацентрифугированию (150 000 g, Beckman Coulter Optima L-90K, ротор SW-27, 2 часа, 4 ∘C). Фракцию цитозоля (S150) собирали и обрабатывали смесью нуклеаз: нуклеаза S1 (20 Ед / мл, Serva Heidelberg, Германия) и РНКаза A (5 мкг / мл, Serva Heidelberg, Германия) в течение 40 мин (37 ∘C., pH 7,7). Затем к полученному лизату добавляли 100 мкл смеси двух протеаз: протеиназы K (10 мкг / мл, Serva Heidelberg, Германия) и трипсина (10 мкг / мл, Serva Heidelberg, Германия) и инкубировали в течение 60 мин (37 ∘C, pH 8,0). Полученный лизат подвергали ультрафильтрации на фильтре Diaflo Y5.0 при 800 фунт / кв. Дюйм (Amicon SQ600, Merck Millipore, США). Полученную высокомолекулярную фракцию, устойчивую к нуклеазам и протеазам, растворяли в 20 мМ буфера Трис / ЭДТА (20 мМ / 1,5 мМ, pH 8,2) и анализировали калориметрически. Объем полученных образцов измеряли с точностью ± 1% шприцами Microliter 700, Hamilton, США. Концентрацию белка в исходной фракции цитозоля определяли по методу Брэдфорда [29].

0.2. Панавир концентрация

Спектр поглощения Панавира имеет характерный пик в области 190 нм (рис. 2), что позволяет калориметрически измерить концентрацию. Коэффициент экстинкции панавира определяли для растворов панавира в буфере Трис / ЭДТА (20 мМ / 1,5 мМ, pH 8,2) на спектрофотометре Lambda 1050 (Perkin Elmer, США) в диапазоне концентраций 100–1200 нг / мл. Для коэффициента экстинкции получено значение (3,28 ± 0,09) · 103 мл / (нг · см). Чтобы определить концентрацию панавира, мы сравнили оптическую плотность высокомолекулярной (HMW) и устойчивой к нуклеазе / протеазе фракции цитоплазмы клеток, полученной из культур, обработанных и не обработанных панавиром. Разница в оптических плотностях при 190 нм полностью объясняется потреблением клетками частиц панавира.


Рисунок 2: Нормированные по площади спектры поглощения водного раствора Панавира (зеленый), цитозольной фракции клеток HL-60 (синий) и HMW фракций цитозоля клеток HNEpC, обработанных панавиром (красный).

Выпуск ATP

После инкубации клеток с панавиром в среду добавляли праймер АТФ до концентрации 2,5 мМ вместе с сукцинатом (1,5 мМ) и 32P-ортофосфатом (1,0 мМ) [30]. Образцы инкубировали в течение 60 мин (37 ∘C), и сразу после окончания инкубации их смешивали с ледяным Triton X100 (2,0%, об. / Об.) / 10 мМ Трис-HCl (pH 7,45) и инкубируют 2 часа. Пул низкомолекулярных соединений экстрагировали ледяным ацетоном (10 об. / Об.), А осадок осаждали центрифугированием (20000 об / мин, 20 мин, QS70, Сорвалл, США). Экстракцию повторяли трижды. Полученный экстракт разделяли с помощью ВЭЖХ: стационарная фаза ODS S5CN, линейный градиент пиридина 10–60% на основе 10% метанола, колонка Altex-1800 15x280 мм, 22 ∘C, 2000 psi, 2,0 A254 в 50 мкл введенной пробы ( Gilson W100 UV254, детектирующая система ВЭЖХ). Пики АТФ собирали для дальнейшего измерения концентрации 32P в диоксановом сцинтилляторе Koch Light Beta SL20 с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика JR880 (Wallac, Финляндия).

Активность ДНК-полимеразы Каталитическую активность измеряли методом Сакагучи и Бойда [31], адаптированным для инкубационного объема 0,15 мл: 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0) / 8,0 мМ дитиотреитол / 15 мМ MgCl2 / 15% глицерина (об. / Об. ) / 27 мкг действующей ДНК, тимус теленка / по 50 мкг каждого из dATP, dCTP, dTTP, dGTP / 0,25 мкмоль [Methyl-1,2- 3 H] dTTP (90–120 Ки / ммоль, NET520A, NEN) / 150 мМ NaCl. Меченый тритием нуклеотид был приобретен в New England Nuclear, США. Эти значения концентраций соединений сначала были оптимизированы как для pH 6,0–9,0, так и для концентрации MgCl2 5,0–50,0 мМ. Эти образцы смесей предварительно инкубировали при 37 ° C в течение 60 мин. Затем к каждому из этих рабочих образцов добавляли 5,0–7,5 мкг чистого фермента и инкубировали при 37 ° C еще 60 мин. Образцы для инкубации на льду, а также образцы, обработанные трипсином (20 мкг / мл трипсина, Merck GmbH, Германия, 37 ° C), были взяты в качестве контроля. Постинкубационные смеси подвергали количественной экстракции ультрамикро-количеств ДНК с использованием набора для экстракции геномной ДНК AccuPrep (Bioneer Corp., Корея), как описано Миками и др. [32] и модифицировано Харатианом и др. [33].

Извлеченные аликвоты ДНК использовали для электрофоретического определения размеров цепей ДНК, обработанных DNApolβ [34], и для измерения [3H] -радиоактивности в счетчике Wallac 2200LX LS (Wallac OY, Финляндия). Значения специфической каталитической активности DNApol® выражали в [3H] cpmDNA / мг фермента. Ультрамикро количества белка оценивали согласно Fukami et al [35]. Измерения ультрамикроколичеств ДНК проводили в разбавленных водных растворах, как описано M¨uller et al [36]. Кинетические константы, kM (мМ) и Kcat ([M dTTP / мин] / мг фермента), оценивались по скоростям истощения пула свободного dTTP [37], измеренным с помощью анализа HPLC растворимых в ацетоне фракций до и после инкубационные смеси: колонка Altex 1800E (18 × 220 мм) / неподвижная фаза ODS-S5CN / подвижная фаза, линейный градиент пиридина 10–60% на основе 10% вода-метанол / 2000 фунтов на кв. дюйм при 22° C / аналитическая система для ВЭЖХ Waters DL600 [37, 38]. Индолсодержащие соединения. Общее количество индолсодержащих соединений, распределенных по поверхности частиц панавира, определяли и количественно оценивали с помощью мультиколлекторного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой (аналитическая система Aurora M90 QS, Brucker, США). Программное обеспечение IUPAC MG410 и пакет базы данных использовали для определения количеств производных индола.

Результаты и обсуждение

Состояние повышенной ответственности (SINRES)

Экспериментально показано, что клетки врожденного иммунитета, в частности естественные клетки-киллеры, способны приобретать иммунную память, аналогичную клеткам адаптивного иммунитета, и впоследствии повышать их активность [9, 10, 11]. de Laval et. al. показали, что «память» о неспецифическом иммунитете также могут обеспечивать миелоидные клетки (моноциты, макрофаги и нейтрофилы), демонстрирующие высокое фенотипическое разнообразие и пластичность [39]. Последнее особенно характерно для макрофагов, которые приобретают так называемые «долгосрочные противомикробные навыки» с использованием эпигенетических механизмов, принципиально отличных от тех, которые запускают созревание клеток адаптивного иммунитета [12]. Клеточная основа такого «натренированного» иммунитета и гетерологичной защиты от вторичных инфекций заключается в функциональном перепрограммировании клеток врожденного иммунитета, которое было впервые обнаружено у беспозвоночных [13].

Живые аттенуированные вакцины (например, БЦЖ) или структуры клеток патогена (например, бета-глюканы или липополисахариды) могут обеспечить долгосрочное повышение антимикробной активности миелоидных клеток из-за конформационных изменений упаковки хроматина, изменяющих ген паттерны экспрессии [39]. Следовательно, стимуляция клеток врожденного иммунитета может оставить своего рода «эпигенетический рубец», набор экспонированных энхансеров и промоторов генов защиты хозяина. Каждый элемент такого «рубца», благодаря своей открытости в результате метилирования ДНК, может служить основой повышенной реактивности в ходе реализации приобретенной программы защиты [40]. Эти наблюдения подтверждают несколько эпидемиологических исследований: например, БЦЖ обладает плейотропным действием, снижая частоту вирусных инфекций [41]. Описанные выше механизмы могут служить субстратом для развития SINRES. Состояние SINRES должно обеспечивать адекватную иммунологическую реактивность в ответ на любой вид инфекции, но в то же время не наносить вред организму, ограничивая его активность по принципу обратной связи. Действительно, для поддержания гомеостаза своевременное прекращение иммунного ответа так же важно, как и его начало, что наглядно продемонстрировала пандемия COVID-19.

Длительные воспалительные процессы, выходящие далеко за рамки адекватного ответа, обладают значительной «внутренней токсичностью» и могут вызывать повреждение тканей [42]. Определенные элементы врожденного иммунитета, в частности макрофаги, играют ключевую роль в восстановлении гомеостаза при различных патологических процессах, как инфекционных, так и неинфекционных, таких как онкологические, аутоиммунные, нейродегенеративные, хронические воспалительные заболевания кишечника и легких [43, 44, 45]. Следовательно, стало разумным предположить, что в состоянии SINRES организм должен быть потенциально способен противостоять любым повреждающим факторам, включая вирусы, вызывающие вирусные респираторные инфекции, а также должен быть в состоянии контролировать хронические вирусные заболевания.

Секреция АТФ и МИФ

Клеточный стресс (вызванный, например, инфекцией) приводит к выбросу АТФ, АДФ и других нуклеотидов во внеклеточное пространство [46, 47]. Внеклеточные нуклеотиды активируют иммунные клетки через систему пуринергических рецепторов [48, 49, 50, 51, 52, 53]. Пуринергические рецепторы присутствуют в мембранах многих типов клеток, особенно в мембранах всех иммунных, эпителиальных и эндотелиальных клеток. Таким образом, внеклеточный АТФ может активировать все элементы неспецифического (врожденного) иммунитета, включая противовирусный иммунитет [54,55].

Внеклеточные нуклеотиды действуют как аутокринные и паракринные сигналы, активируя пуринергические рецепторы P2, которые вызывают провоспалительные иммунные реакции, которые представляют собой фазу острого воспаления, продолжающуюся от нескольких минут до нескольких часов. Со временем внеклеточные нуклеотиды метаболизируются до аденозина, что приводит к снижению сигнала от P2 и увеличению сигнала через противовоспалительные аденозиновые пуринергические рецепторы P1, что является подострой фазой, продолжающейся от часов до нескольких дней [20]. Относительно высокие концентрации внеклеточного АТФ (в миллимолярном диапазоне) вызывают преимущественно провоспалительные эффекты из-за активации низкоаффинного рецептора P2X7, в то время как низкие (микромолярные) концентрации АТФ оказывают преимущественно толерогенный / иммунодепрессивный эффект, обеспечиваемый активацией. высокоаффинного рецептора P2Y11 [56, 57].

Следовательно, внеклеточный АТФ может служить как инициатором, так и терминатором иммунных ответов. Следуя нашим ожиданиям, обработка культуры клеток HL-60 панавиром привела к секреции АТФ во внеклеточную среду (рис. 3). Отметим, что этот эффект наблюдался как для зрелых нейтрофилов, так и для исходных клеток HL-60. Эффект наблюдался как в физиологическом диапазоне концентраций панавира (2,5–10 нг / мл, рис. 3A), соответствующем фармакологической дозе 200 мкг для взрослого [16], так и при повышенных концентрациях (рис. 3B). Во всех случаях в присутствии Панавира концентрация АТФ во внеклеточной среде была на порядок выше фонового значения 18,5 ± 0,6 нг на миллион клеток. При терапевтической концентрации Панавира внеклеточная концентрация АТФ достигает максимума через 12 часов после лечения. Таким образом, можно предположить, что характерное время АТФ-опосредованного действия Панавира на клетки иммунной системы составляет не менее одного дня. Обратите внимание, что эффект был на 12 ± 0,6% более выраженным для зрелых нейтрофилов, чем для незрелых клеток HL-60.


Рисунок 3: Высвобождение АТФ незрелыми (кружки) и зрелыми (квадраты) клетками HL-60 под влиянием физиологических (А) и повышенных (В) концентраций панавира: 2,5 (синий), 10 (красный), 100 (оранжевый)) и 1000 нг / мл (фиолетовый). Серые пунктирные линии показывают фоновую концентрацию АТФ в культуральной среде.

Концентрация внеклеточного АТФ в эпителиальных клетках носовой полости (NEpC) в культуре клеток составляла 680 ± 50 нг на миллион клеток, что более чем в 4 раза превышает концентрацию АТФ в культуре клеток HL-60.


Таблица 1: Скорость синтеза ДНК и РНК (3H cpm / мг ДНК) изолированными ядрами клеток HL-60

Клетки HNEpC образуют ворота для SARS-CoV-2 и других инфекций, передающихся воздушно-капельным путем, поэтому их восприимчивость к панавиру заслуживает внимания. С другой стороны, фагоцитоз чужеродных частиц, например частиц панавира, может стимулировать неспецифический иммунитет, который ранее был описан для многих элементов системы неспецифического иммунитета [58]. Последнее создает возможность для развития состояния СИНРЕС и повышения сопротивляемости организма. Среднее содержание АТФ в клетках HL-60 составляло 4,4 ± 0,2 фмоль на клетку [59]. Следовательно, один миллион клеток HL-60 содержит около 4,4 нмоль или 2,2 мкг АТФ. Таким образом, в наших экспериментах клетки выделяли в окружающую среду около 5–6% АТФ, содержащегося в них, при обработке панавиром в физиологических концентрациях. Это очень значительная величина, и такая потеря эквивалентов энергии должна сказаться на интенсивности синтетических процессов в клетке, что было обнаружено экспериментально (табл. 1).

Обработка изолированных ядер клеток HL-60 панавиром в высоких концентрациях приводила к более чем двукратному снижению скорости синтеза нуклеиновых кислот. Существенным различием между клетками HNEpC и незрелыми клетками HL-60 является различная активность гена, кодирующего фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF), который представляет собой эволюционно древний белок, гомологи которого были обнаружены у широкого круга организмов позвоночных. цианобактериям [21]. MIF - это мультипотентный белок, участвующий в патогенезе многих инфекционных и аутоиммунных заболеваний. В отличие от многих других цитокинов, которые секретируются во время антигенной стимуляции, MIF постоянно экспрессируется и сохраняется в межклеточных пулах [21]. В целом MIF представляется важнейшим регулятором многих клеточных процессов, и его нарушение может приводить к патологическим состояниям.

По этой причине MIF является очевидной мишенью для изучения потенциальных терапевтических агентов против инфекционных, воспалительных и пролиферативных расстройств [60, 61]. Отметим, что MIF влияет, в частности, на ответ иммунокомпетентных клеток на вирусные и бактериальные инфекции [62]. Внутриклеточный синтез MIF в культуре клеток HNEpC, обработанной раствором Панавира (10 нг / мл), составил 1850 ± 60 против 450 ± 50 пг на миллион клеток в контроле. Таким образом, стимуляция эпителиальных клеток носового эпителия панавиром может стимулировать активность иммунных клеток, что, в свою очередь, должно сократить время, необходимое для развития ответа.

Фагоцитарная активность

Одним из важных вопросов, касающихся физиологического действия Панавира, является способность довольно крупных частиц Панавира проникать в цитоплазму клеток. Учитывая размер конденсированного ядра этих частиц, равный ∼ 150 нм [15], наиболее вероятным путем проникновения должен быть фагоцитоз. В культуре незрелых клеток HL-60 89% клеток составляют миелобласты и промиелоциты, и только 1% представляют собой нейтрофилы с преждевременными полосами [27]. Обработка культур ДМСО и некоторыми другими полярными агентами в течение 3–6 дней приводит к их созреванию [27, 28]. В процессе созревания интенсивность специфического иммунного ответа, в частности способность к фагоцитозу, многократно возрастает [27]. В наших экспериментах даже незрелые клетки HL-60 проявляли значительную фагоцитарную активность по отношению к частицам панавира в высокой концентрации (20 мкг / мл), которая в зрелых клетках увеличивалась всего на 40% (табл. 2). Обратите внимание, что обработка как зрелых, так и незрелых клеток Панавиром в присутствии АТФ приводит к дополнительному увеличению фагоцитарной активности еще на 40-50%, что больше не связано с созреванием клеток, но является физиологической реакцией на присутствие пуриновых тринуклеотидов в среде [48, 49, 50, 51, 52, 53].

Поскольку обработка клеток HL-60 панавиром индуцирует секрецию АТФ, а АТФ способствует фагоцитозу, существует петля положительной обратной связи, которая усиливает иммуностимулирующий эффект панавира. Аналогичные результаты были получены, когда культуру зрелых клеток HL-60 обрабатывали нейтральными частицами германия (диаметром около 400 нм), которые, как и частицы панавира, потреблялись клетками. Кроме того, наличие в среде крупных частиц германия приводит к увеличению фагоцитоза частиц панавира в 2 раза в зависимости от концентрации (табл. 2). Наблюдался также противоположный эффект, но он был гораздо менее явным: частицы панавира сравнительно меньшего размера усиливали фагоцитоз частиц германия только на 14%. Примечательно, что при обработке панавиром в концентрации 2,5 нг / мл клетки HNEpC поглощали частицы препарата более активно, чем клетки HL-60, и в среднем поглощали 3,8 ± 0,2 частицы на клетку.

Индол, содержащий компоненты Панавира

Химический состав частиц панавира наследует некоторые особенности растительной ткани, из которой они были выделены (меристема побегов картофеля, [15]). Активно делящиеся меристематические ткани действуют как источник ауксинов, растительных гормонов, регулирующих почти все аспекты роста и развития растений, включая рост и дифференцировку клеток [63, 64]. Ауксины - индолсодержащие соединения, что позволяет рассматривать их как химические аналоги серотонина [65], который также был обнаружен в тканях растений. Функции серотонина растений не выявлены.

Точно установлено, но сообщалось, что серотонин является функциональным ингибитором ауксина и участвует в дифференцировке корней [65]. У млекопитающих и людей серотонин участвует в процессах аллергии и в воспаление, увеличивает проницаемость сосудов, усиливает хемотаксис, увеличивает миграцию лейкоцитов в области воспаления, увеличивает содержание эозинофилов в крови, усиливает дегрануляцию тучных клеток и высвобождение других медиаторов аллергии и воспаления [66]. Таким образом, иммуностимулирующие свойства Панавира могли проявиться благодаря наличию растительных аналогов серотонина (ауксинов и других индолсодержащих соединений).


Таблица 2: Поглощение наночастиц панавира и Ge (количество частиц на клетку) незрелыми и созревшими ДМСО клетками HL-60.

Точно установлено, но сообщалось, что серотонин является функциональным ингибитором ауксина и участвует в дифференцировке корней [65]. У млекопитающих и людей серотонин участвует в процессах аллергии и в воспаление, увеличивает проницаемость сосудов, усиливает хемотаксис, увеличивает миграцию лейкоцитов в области воспаления, увеличивает содержание эозинофилов в крови, усиливает дегрануляцию тучных клеток и высвобождение других медиаторов аллергии и воспаления [66]. Таким образом, иммуностимулирующие свойства Панавира могли проявиться благодаря наличию растительных аналогов серотонина (ауксинов и других индолсодержащих соединений). По результатам плазменной масс-спектрометрии количество индолсодержащих групп на поверхности частиц Панавира составило 38,2 ± 2,6 мкг на грамм Панавира. С учетом молекулярной массы частиц панавира (∼ 3GDa [15]) количество индольных групп на поверхности отдельной частицы составит около 300 единиц. Следовательно, в одной терапевтической дозе Панавира (∼ 200 мкг) количество таких групп будет ∼ 10-11 моль, а их концентрация в крови человека после применения Паравира будет примерно 2 · 10-9 г / л или примерно 10 моль. −11 М.

Это значение на пять порядков ниже естественной физиологической концентрации серотонина, которая составляет около 150 { 200 нг / мл или (1,3 {1,8) · 10-6М [9]. Однако, если хотя бы одна частица панавира попадает в клетку, концентрация индольных групп внутри клетки оказывается в тысячу раз больше (~ 10-8 М), что уже сопоставимо с физиологическими концентрациями серотонина. Сделанная оценка предполагает, что предполагаемая биологическая активность индольных радикалов, которые могут высвобождаться во время внутриклеточной деградации частиц, не может быть исключена при анализе физиологических эффектов Панавира. Следовательно, здесь мы явно наблюдаем взаимодействие между пуринергической и серотонинергической системами, усиливая эффект положительной обратной связи воспаления и подавления инфекции.

Токсичность и эффективность Панавира

У мышей LD50 Панавира для внутрибрюшинного введения составляет 1240 мг / кг, что позволяет отнести Панавир к малотоксичным препаратам [67]. В изученных терапевтических дозах Панавир не оказывает аллергического, местнораздражающего, тератогенного, эмбриотоксического и мутагенного действия. Терапевтический индекс (отношение LD50 к ED50) Панавира составляет целых 413 000 [67]. Следовательно, Панавир имеет одно из самых широких «терапевтических окон» среди зарегистрированных препаратов. Такой большой терапевтический индекс не является обычным в классической фармакологии, поскольку малотоксичные препараты обычно имеют низкую терапевтическую активность. Однако в случае Панавира препарат представлен наночастиц довольно большого размера, а терапевтическая доза (200 мкг) таких частиц содержит их всего около 1010, что в миллион раз меньше значений, характерных для обычных низкомолекулярных препаратов. Это значение соответствует концентрации 10–13M и относится к диапазону сверхнизких доз биологически активных веществ, обычно демонстрирующих чрезвычайно низкое токсическое действие [68]. Однако многие лекарства в сверхмалых дозах все же демонстрируют значительные терапевтические и / или физиологические эффекты [68].

Заключение

Обобщая полученные результаты, можно выделить несколько основных моментов. Физиологическая активность Панавира на клеточном уровне опосредуется фагоцитозом его наночастиц (в наших экспериментах - клетками HL-60). Мы склонны рассматривать акт фагоцитоза как первичное событие, вызывающее все последующие эффекты. За фагоцитозом частиц панавира следует активный экзоцитоз АТФ и MIF, который, в свою очередь, активирует все виды иммунных клеток и, в частности, зрелые нейтрофилы, и усиливает фагоцитоз. Эта взаимосвязь делает петлю положительной обратной связи, необходимую для развития любого значимого физиологического эффекта. На внутриклеточном уровне физиологическая активность Панавира может быть связана с метаболизмом индолсодержащих ауксинов, обнаруженных в частицах Панавира и обычно присутствующих в активно делящихся меристематических клетках растений. Ауксины и их метаболиты могут обладать серотониноподобной активностью, что объясняет наблюдаемую провоспалительную активность Панавира.

Следовательно, супрамолекулярная природа Панавира, представленного довольно крупными (несколько МДа) частицами, становится существенной, поскольку более мелкие частицы не будут эффективно фагоцитироваться, в то время как ткань происхождения Панавира становится решающей из-за высокого уровня ауксинов, обычного для меристем. К счастью, два фактора, описанные выше, соединились в Панавире и сделали его хорошим стимулирующим агентом для иммунной системы. Неспецифическая стимуляция иммунной системы может вызвать так называемое состояние SINRES (состояние повышенной ответственности), заставляя иммунную систему формировать более резкие ответы на любой вид антигенной стимуляции по сравнению с «нормальным» состоянием [9, 10, 11, 12]. Мы предполагаем, что перевод иммунной системы в состояние SINRES мог бы стать эффективным способом противодействия инфекциям, позволяющим снизить заболеваемость и сэкономить время на разработку и производство целевых препаратов. -модулирующие препараты, по-видимому, имеют особое значение в случаях пандемий, таких как современный COVID-19.

Вопросы и ответы

ЗАДАТЬ ВОПРОС СПЕЦИАЛИСТУ


Вы можете задать вопрос в специальном разделе сайта панавир и получить развернутый ответ специалиста

Награды
ЛАУРЕАТ ПРЕМИИ ПРАВИТЕЛЬСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 2013
Распоряжение №230-р от 20 февраля 2014г. Правительства Российской Федерации
Новости

Для врачей


Для пациентов


ПОДПИСКА НА НОВОСТИ МЕДИЦИНЫ

Чтобы подписаться на новости медицины введите Ваш адрес электронной почты в поле ниже
Подробнее о подписке